THèSE

présentée par

Alassane WELE

Soutenue le 30 juin 2003

Matériel et méthodes

I-Données générales

I-1-Analyse des cyclopeptides par spectrométrie de masse

Les spectres de masse TOF-MS et TOF-MS/MS ont été effectués soit sur un appareil MALDI-TOF avec une ionisation par laser, soit sur un appareil API QSTAR Pulsar i avec une ionisation en Electrospray à une tension de 5200 eV. Le solvant utilisé pour dissoudre les échantillons a été le méthanol.

I-2- Résonance Magnétique Nucléaire

Les spectres ont été réalisés soit sur un spectromètre Bruker AC 300 pour les spectres 1D ¹³C, soit sur un spectromètre Bruker Avance 400 équipés de logiciel X-WIN NMR (version 2,6) pour les études 2D. Les données utilisées pour la modélisation moléculaire ont été acquises soit sur un spectromètre Varian Unity 500 soit sur un spectromètre Inov A 600 équipé de logiciel XEASY. Des volumes de 0,4 ml de solution peptidique (10 mg) dans DMSO-d₆ (ou Pyridine-d₅ ou MeOD₃) en tubes de 5 mm (Wilmad) ont été généralement utilisés (les tubes sont préalablement dégazés dans le cas de la modélisation). La température d’acquisition a été de 298°K pour tous les cyclopeptides, sauf indication contraire (à l’exception de la cyclosénégaline A pour laquelle nous avons utilisé la température de 318°K).

I-2-1-Spectres de RMN 1D ¹H et ¹³C

Les spectres de RMN 1D ¹H ont été enregistrés à 400,13 MHz et l’acquisition a été réalisée avec une mémoire de taille de 32 K, sur une moyenne spectrale d’environ 4401 Hz (DMSO-d₆ et CD₃OH) et 5531 Hz (pyridine-d₅). Le nombre de scans est de 144 pour le DMSO-d₆ et le CD₃OH et de 200 scans pour la pyridine-d₅. Les spectres de RMN ¹³C ont été réalisés à 100,62 MHz, avec une taille de mémoire de 32 K et sur une moyenne spectrale de 20000 Hz, 66852 scans pour le DMSO-d₆ et le CD₃OH et 76398 pour la pyridine-d₅ ont été utilisés. Le calibrage des spectres a été réalisé sur la raie centrale du signal correspondant au solvant DMSO-d₆ ou pyridine-d₅ ou CD₃OH.

*en ¹H, sur la raie centrale du quintuplet lié à la résonance du proton du CD₂H calibrée à 2,49 ppm par rapport au TMS pour le DMSO-d₆.

*en ¹³C, sur la raie centrale du septuplet à 39,5 ppm lié à la résonance du carbone du groupe CD₃ par rapport au TMS pour le DMSO-d₆.

I-2-2-Spectres de RMN 2D ¹H-¹H et ¹H-¹³C

Les spectres COSY sont enregistrés à 400,13 MHz sur un total de 512 expériences constituées chacune d’environ 4 scans pour une moyenne spectrale de l’ordre de 4401 Hz pour DMSO-d₆ et le CD₃OH, et 8 scans pour une moyenne spectrale de 5531 Hz pour la Pyridine-d₅ (TD = 4K).

Les spectres de RMN TOCSY ont été réalisés à 400,13 MHz sur un total de 512 expériences de 8 scans pour le DMSO-d₆ et le CD₃OH , et 16 scans pour la Pyridine-d₅ et avec un temps de mixage de 120 ms (la valeur du temps de mélange choisie pour une constante de couplage J_H-H de 1Hz, a permis d’observer la totalité des couplages tout au long des chaînes latérales des résidus). La moyenne spectrale est de l’ordre de 4401 Hz (DMSO-d₆ et CD₃OH) et 5531 Hz (Pyridine-d₅)

Les spectres de RMN ROESY ont été enregistrés à 400,13 MHz sur 512 expériences de 40 scans chacune avec un temps de mixage de 150 ms. La moyenne spectrale est de l’ordre de 4401 MHz et 5531 Hz.

Les spectres de corrélation directe ¹H-¹³C HSQC ont été réalisés à 400,13 MHz en dimension 2 (dimension proton) et à 100,62 MHz en (dimension carbone), avec une taille mémoire 2K et sur 512 expériences.

Les moyennes spectrales utilisées sont de l’ordre de 4401 et 5531 Hz. Le nombre de scans est de 40 pour le DMSO-d₆ et le CD₃OH , et de 64 pour la Pyridine-d₅. La valeur de la constante de couplage utilisée pour établir le délai nécessaire à la sélection des protons couplés à l’atome de carbone a été estimée à ¹J_CH = 135 Hz. Ce délai équivaut à ¼ CH (1,85 ms).

Les expériences HMBC sont enregistrées à 400,13 MHz sur une fréquence moyenne de 4401 MHz. Le délai d’évolution qui précède le pulse ¹³C pour la création de magnétisation à travers les liaisons a été fixés à 70 ms. Ce délai équivaut à d J_CH et correspond à une constante de couplage à longue distance de 7Hz. Les corrélations directes ¹H-¹³C ont été supprimées grâce à l’utilisation de filtre (low pass J-filter).

I-3- Modélisation moléculaire sous contraintes RMN

Les spectres ont été enregistrés sur spectromètres UNITY 500 et INOV A600. La gamme de température testée pour favoriser la forme majoritaire s’étale de -15°C à 10°C, et nous avons travaillé à -10°C.

Le spectre TOCSY a été enregistré avec un temps de mélange de 80 ms et celui des NOESY à 120 et 300 ms. L’analyse des cartes a été effectuée avec le logiciel XEASY.

I-4-Radiocristallographie par les rayons X

Les cristaux ont été obtenus par dissolution dans un petit cristallisoir de 10 à 15 mg de produits dans 3 ml de méthanol. Après une dizaine de jours, des cristaux incolores se forment dans la solution.

La préparation des échantillons et la collecte des données ont été réalisées par Claudine Mayer à l’Université de Paris 6.

1-4-1-Préparation des échantillons et collecte des données

Après évaluation au microscope optique de la qualité des cristaux obtenus, un cristal incolore de la cycloréticuline A de forme prismatique, de dimensions 100 m x 100 m x 200 m, est collé sur une tige en verre.

Les cristaux de la cycloréticuline C et de la cyclosquamosine M sont placés par aspiration dans un capillaire en verre à rayons X de 0,5 à 1 mm de diamètre selon la taille contenant à une extrémité quelques microlitres de liqueur mère qui permettent de maintenir une pression de vapeur suffisante pour éviter l’assèchement total du cristal. Le capillaire est scellé par de la cire puis monté sur un tête goniométrique afin d’assurer le réglage manuel du cristal dans le faisceau de rayons X.

Les mesures des intensités des données de diffraction des trois cyclopeptides ont été réalisées sur un diffractomètre CAD4 Enraf-Nonius équipé d’une anode de cuivre tournante, dont la raie Cu-Ka (l = 1,5418 Å) est sélectionnée par un monochromateur de graphite. Toutes les données ont été collectées à une température de 24 ± 1°C.

La détermination de la symétrie, des paramètres de maille, des conditions d’extinction et du groupe d’espace est réalisée de manière automatique sur le diffractomètre à l’aide de 25 réflexions.

Les différentes étapes de la collecte des intensités sont les suivantes :

i)-Recherche et affinement, à partir de quelques réflexions, des paramètres de maille et détermination de la matrice de passage du référentiel fixé du diffractomètre à celui mobile du cristal.

ii)-Choix d’une vitesse de balayage, d’un domaine angulaire et mesure des taches de diffraction. Selon la symétrie, l’acquisition portera sur la moitié, le quart, etc… de l’espace réciproque, en essayant de trouver le meilleur compromis entre vitesse de mesure et nombre de réflexions mesurées.

iii)-Un traitement de données est nécessaire car les intensités mesurées sont affectées par un certain nombre de facteurs d’atténuation. Les uns sont liées à l’angle de diffraction q (corrections de Lorentz- Polarisation), les autres sont liés au fait que l’intensité I des rayons X diminue après la traversée d’un cristal : dans notre cas, une correction empirique d’absorption est appliquées aux données (données par le logiciel grâce à la mesure toutes les 100 réflexions des intensités de trois réflexions représentatives). Seules les mesures significatives sont retenues, puis les réflexions équivalentes sont moyennées, selon la classe de Laue retenue.

1-4-2-Détermination de la structure et affinement

Les structures des trois cyclopeptides ont été déterminées en utilisant le programme SIR97 basé sur le principe des méthodes directes (Altomare et al., 1999). L’affinement, basé sur l’ajustement des carrés des facteurs de structure observés aux carrés des facteurs de structure calculés par la méthode des moindres carrés, des trois structures est également réalisé par le programme SIR97. Les progrès de l’affinement sont suivis par la convergence vers des valeurs minimales du facteur d’accord R, qui mesure l’erreur relative moyenne sur l’ensemble des facteurs de structure. Il est donné par l’équation suivante :

avec F_obs(hkl), les facteurs de structure observés et F_cal(hkl) les facteurs de structure calculés.

conformation			angles dihédraux en degrés
			f2	y2	f3		y3
hélice a droite		-55		-45	-55	-45
hélice 310 droite		-60		-30	-60	-30
gauche		60		30	60	30
feuillets b
antiparallèle		-140		135	-140	135
parallèle		-120		+110	-120	+110
coude b	I	-60		-30	-90	0
	I'	60		30	90	0
	II	-60		120	80	0
	II'	60		-120	-80	0
	III	-60		-30	-60	-30
	III'	60		30	60	30
	IV		2 des 4 angles différent de plus de 40°
			des valeurs ci-dessus
	V	-80		80	80	-80
	V'	80		-80	-80	80
	VIa	-60		+120	-90	0
	VIb	-120		+120	-60	0
	VII		repli de la chaîne protéique
				~180°			<60°
	VIII	-60		-30	-120	+120
tours g
	normal	70° à 85°		-60° à -70°
	inversé	-70° à -85°		60° à 70°

Tableau VIII-1 : Valeurs des angles f et y selon les différents types de conformations des peptides

I-5-Détermination du pouvoir rotatoire

Les pouvoirs rotatoires des cyclopeptides a été mesuré par un polarimètre Perkin Elmer 341 et les [a]_D²² sont données en g pour 100 ml.

I-6- Points de fusion

Le point de fusion est la mesure de la température de fusion du solide. Les mesures ont été faites avec un appareil à capillaires, Büchi Melting Point B-545. Le solide est placé dans un capillaire, et chauffé par une résistance électrique (Tableau VIII-2).

Espèces	Cyclopeptides	Points de fusion MeOH (°C)	Pouvoir rotatoire (MeOH ; c g/100 ml)
A. cherimola	Chérimolacyclopeptide A	192-193	-8,5 (0,1)
	Chérimolacyclopeptide B	228-229	-8,3 (0,3)
	Chérimolacyclopeptide C	233-234	-8,4 (0,1)
	Chérimolacyclopeptide D	220-221	-3,2 (0,1)
	Chérimolacyclopeptide E	ND	-4,7 (0,2)
	Chérimolacyclopeptide F	277-278	-5,2 (0,1)
	Chérimolacyclopeptide G	213-214	-3,4 (0,3)
	Chérimolacyclopeptide H	139-140	-6,8 (0,1)
	Chérimolacyclopeptide I	200-201	-7,3 (0,1)
A. reticulata	Cycloréticuline A	225-226	-17,2 (0,1)
	Cycloréticuline B	216-217	-6,3 (0,1)
	Cycloréticuline C	269-270	-2,7 (0,1)
	Cycloréticuline D	255-256	-7,0 (0,1)
	Cycloréticuline E	239-240	-8,3 (0,1)
	Cycloréticuline F	244-245	-7,7 (0,2)
A. muricata	Annomuricatine C	284-285	-2,7 (0,1)
	Annomuricatine D*	ND	-2,6 (0,1)
A. senegalensis	Cyclosénégaline A*	ND	-2,6 (0,1)
	Cyclosénégaline B	246-247	-5,7 (0,1)
A. squamosa	Cyclosquamosine M	260-261	-8,0 (0,2)

Tableau VIII-2 : Mesures de point de fusion et de pouvoir rotatoire [a]_D²²